周成明1 许彬1，2 张金屯2﹡ 高文远3
(1.北京时珍中草药技术有限公司, 北京 102609; 2. 北京师范大学生命科学学院, 北京 100875；3.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072)
摘 要：采用扩增片段长度多态性(AFLP)标记技术对乌拉尔甘草栽培新品系“民勤1号”、“喀什1号”、常规栽培品系内蒙古乌拉尔甘草和胀果甘草进行遗传基础分析，在UPGMA聚类中被划分为四组，指纹图谱显示出“民勤1号”、“喀什1号”分别具有的特异性谱带数量分别为6条和2条。结果表明 “民勤1号”、“喀什1号”形成了独特的基因构成，可以作为乌拉尔甘草优良栽培新品系。
关键词：乌拉尔甘草；良种选育；AFLP；指纹图谱
Study on Selective Breeding of Glycyrrhiza uralensis (Ⅰ)
——AFLP analysis for Glycyrrhiza
ZHOU Cheng-ming1 XU Bin1，2 ZHANG Jin-tun2 GAO Wen-yuan3
(1. Beijing Shizhen herbal medicine technology Ltd.,Beijing 102609, China; 2. College of Life Science of Beijing Normal University, Beijing 100875, China; 3.The College of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)
Abstract：AFLP was used to evaluate the genetic polymorphism of new breed of Glycyrrhiza uralensis “Minqin No.1”, “Kashi No.1”, usual cultivar Nei Mongglo and Glycyrrhiza inflata Bat. Cluster results showed that all the populations studied were clustered into 4 groups, and fingerprinting showed the peculiar boot of the 2 new breeds were 6 and 2. The results showed that “Minqin No.1”, “Kashi No.1” have inimitable gene structure, and should be used as new breed.
Key words: Glycyrrhiza uralensis; selective breeding; AFLP; DNA fingerprinting
豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza Linn)植物中有3种甘草入药，即乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草[1]。目前只有乌拉尔甘草进行引种大面积栽培，每年产量已达万吨，畅销国内外市场。但目前栽培甘草产品存在单位面积产量、甘草酸含量偏低的问题，许多栽培专家在栽培技术上进行了一系列的研究[2，3，4]，但该问题没有得到很好的解决，主要原因之一是目前还没有选育出农艺性状和品质优良并能够在栽培中进行推广的品系。我们从2001年开始进行乌拉尔甘草优良品系的选育研究，在甘肃民勤选育出具有优良性状的乌拉尔甘草栽培新品系，命名为“民勤1号”，其优良性状表现为植株抗逆性强，越冬芽数量较多，株型好，栽培三年生植株开花、结籽数量多，主根长、直、分叉少，根头直径粗壮，栽培三年生甘草酸含量达到3%以上，单株鲜重平均达到100克，亩产（667m2）根鲜重达到2500公斤，比常规栽培品系内蒙古乌拉尔甘草要高出1000公斤左右，2005年扩繁了100公顷。2004年我们又在新疆的喀什选育出一个优良栽培新品系，命名为“喀什1号”目前已经扩繁了200公顷。
AFLP扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)结合了RFLP和PCR的优点[5]，既具有RFLP可靠性好、重复性高的特点，同时又具有PCR的高效性、安全性和方便性[6]，重复性比RAPD好，被广泛地应用于植物遗传育种方面的研究。
为了确认乌拉尔甘草栽培新品系“民勤1号”、“喀什1号”与目前常规栽培品系内蒙古甘草和胀果甘草在遗传本质上是否有所不同，本文应用AFLP技术对以上四个来源乌拉尔甘草进行遗传基础分析。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用材料为乌拉尔甘草栽培新品系“民勤1号”、“喀什1号”、常规内蒙古乌拉尔甘草和胀果甘草种子，种子由北京时珍中草药技术有限公司周成明采集鉴定。取干种子常规发芽，每种材料分别取10株胚根，混为一份样品，提取DNA组织。
1.2 DNA组织提取
采用CTAB法提取[7] 。
1.3 AFLP分析
模板DNA的酶切、连接、预扩增和选择性扩增的反应液配方和反应程序由北京鼎国生物公司设计进行。
1.4 AFLP图谱分析
应用ABI 377测序仪进行AFLP多态性分析。
1.3 数据处理
将电泳图谱上清晰可见且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，
生成由“1”和“0”组成的原始矩阵。计算多态性位点百分率(p): p=(k/n)×100％，其中k是多态位点数目；n为所测位点总数。用AFLP-SURV 1.0 (Vekemans et al . , 2002)软件计算每个居群的多态位点数, 多态位点百分率。以Jaccard 相似系数为参数用NTSYSpc 2. 0 (Rohlf ,1997) 对40个乌拉尔甘草样品用非加权配对算术平均的方法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean , UPGMA) 进行聚类分析。
2 结 果
2.1 AFLP分析的引物筛选及其标记的多态性
由此对EcoR I标记引物E-AAC、E-AAG、E-ACA、E-ACT、E-ACC、E-ACG、E-AGC、E-AGG(8个)和Mse I 标记引物M-AA、M-AC、M-AG、M-AT、M-TA、M-TC、M-TG、M-TT(8个)完全排列组成的64个引物组合进行筛选，从中选出了8个谱带清晰、带型分布均匀并且多态性高的引物组合，共扩增出1025条带谱，平均每个引物扩增出128条。8对引物共扩增出多态性带540条，多态位点百分率为52.7%，其中44条带为40个样品所共有，平均每对引物扩增出67.5条多态性带(表1)。
表1 适宜于甘草AFLP分析的8个引物组合序列及其扩增结果
Table 2 The base sequence of 8 primer combinations for AFLP analysis; and AFLPs generated among 40 individuals using the eight combinations
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引物组合
Primer combination
|
引物序列
Prime sequence(5′-3′)
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总位点数
Total bands
|
多态位点数
Polymorphic bands
|
多态位点百分率
Polymorphism( %)
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|
E-AAC/M-CAA
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GACTGCGTACCAATTCAAAC
GATGAGTCCTGAGTAACAA
|
129
|
68
|
52.7
|
|
E-AAC/M-CAG
|
GACTGCGTACCAATTCAAAC
GATGAGTCCTGAGTAACAG
|
144
|
80
|
55.6
|
|
E-AAC/M-CTC
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GACTGCGTACCAATTCAAAC
GATGAGTCCTGAGTAACTC’
|
137
|
69
|
50.4
|
|
E-AAG/M-CAA
|
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACAA
|
111
|
59
|
53.2
|
|
E-AAG/M-CAG
|
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACAG
|
143
|
75
|
52.4
|
|
E-AAG/M-CTC
|
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACTC
|
138
|
72
|
52.2
|
|
E-AAG/M-CTT
|
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACTT
|
113
|
56
|
49.6
|
|
E-ACT/M-CTC
|
GACTGCGTACCAATTCAACT
GATGAGTCCTGAGTAACTC
|
110
|
61
|
55.4
|
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总计/平均
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1025/128
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540/67.5
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--/52.7
|
2.2 指纹图谱构建
在筛选出的8对引物组合中，E-AAC/M-CAG组合共扩增出144条带谱，扩增的DNA片段在50bp~450bp之间，其中多态性带谱为80条，共有带64条，多态位点百分率达到了55.6%，为各引物中最高。特异性谱带8条，其中“民勤1号”具有的特征谱带数为6条( 74bp,95bp,113bp,167bp,258bp,300bp)，“喀什1号”具有的特异性谱带数为2条(89bp,357bp)；胀果甘草和内蒙古乌拉尔甘草相比具有5条(98bp,106bp,113bp,171bp,184bp)特异性谱带。因此，该引物组合具有较强的检测不同甘草基因型间遗传变异差异性的能力，用以构建“民勤1号”、“喀什1号”、内蒙古对照和胀果甘草对照的指纹图谱(图1)。
Ⅰ：内蒙古乌拉尔甘草对照；Ⅱ：胀果甘草对照； Ⅲ：喀什1号； Ⅳ：民勤1号
图1 基于引物组合E-AAC/M-CAG的四个来源甘草AFLP指纹图谱
Fig.1 AFLP fingerprinting amplified with primer E-AAC/M-CAG
2.3 聚类分析
依据以上8对引物所扩增出的四个来源甘草的1025个DNA带谱的数据，按照Jaccard 相似性系数进行UPGMA聚类，构建供试材料间的亲缘关系树状图(图2)。
由图中可以看出，四个来源甘草被聚为两组。其中，在0.61处“民勤1号”被分出；在0.65处其他三份样品聚在一起。在0.67处胀果甘草和“喀什1号”被聚为一支，在0.68处内蒙古对照被分离。结果表明，胀果甘草与“喀什1号”亲缘关系最近，内蒙古对照和胀果甘草、“喀什1号”之间亲缘关系也较近，而“民勤1号”与另外三种亲缘关系较远。
3 讨 论
植物在生长过程中，由于自然杂交，基因突变，以及外界恶劣环境条件的长期影响等多种原因，在基因构成上会产生不同程度的变异，而这种变异正是进行作物新品种选择的基础。
1-c10：内蒙古对照； c11-c20：胀果甘草对照； c21-c30：喀什1号； c31-c40：民勤1号
图2 基于AFLP 数据的40份甘草种质的UPGMA 聚类图
Fig. 2 Dendrogram illustrating the genetic relationships among 40
Glycyrrhiza L. accessions based on UPGMA cluster analysis of AFLP data
“民勤1号”、“喀什1号”、胀果甘草分别采集于甘肃、新疆等地的野生种群，我们在对其进行引种栽培和优良品系选育的过程中，发现与常规人工栽培品系内蒙古乌拉尔甘草相比，在单位面积产量、抗性、产品品质等方面具有显著的优势。
UPGMA聚类图表明四种来源甘草被划分为四组，并表现出不同远近的亲缘关系；指纹图谱显示出“民勤1号”、“喀什1号”具有的特异性谱带数量分别为6条和2条。说明由于受到恶劣生长环境的长期影响，两个不同来源乌拉尔甘草经过较长时期的演变之后，已经各自形成了其独有的基因结构。因此我们可以确定经过多年选育的“民勤1号”、“喀什1号”可以作为乌拉尔甘草优良栽培新品系进行进一步的推广。
References：
[1] 中华人民共和国药典第一部，2005版:65-68
[2] Zhou C M, Kong X F. A Study on Cultivation Technigues for Glycyrrhiza uralensis Fisch. in Daxing County Area，Beijing[J]. China Journal of Chinese Materia Medica(中国中药杂志)，2000，25(3):140-143
[3] Zhou C M. the outline of the normative Cultivation Technigues for Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J]. Research& Information on Traditional Chinese Medicine(中药研究与信息). 2003,5(2):25-28
[4] Zhou C M. Cultivation Technigues for Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J]. Xinjiang Farmland Reclamation Science & Technology. 2006(1):14-15
[5] Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995,23(21):4407-4414
[6] Sun Q L, Liang Y R, Ding Z T, et al. AFLP molecular marker technique and its application to tea Genetic and breeding research[J]. Journal of Tea(茶叶),2004,30(4):203-206
[7] Doyle JJ , Doyle JL , 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J ] . Focus , 12 (1) : 13 -15
